纳米羟基磷灰石/丝素蛋白人工骨修复骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.08.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：为获得更加理想的人工骨材料，前期实验制备了纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合人工骨材料。

目的：观察纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合人工骨材料修复骨缺损的效果。

方法：将30只健康成年家兔随机均分为两组，制备单侧股骨中远段骨缺损模型，实验组于骨缺损处植入纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合人工骨材料，对照组于骨缺损处植入单纯羟基磷灰石，植入后4，8，12周取实验侧股骨，进行大体、X射线摄片、生物力学检测及组织学检查。

结果与结论：随着时间的增长，两组生物力学强度逐渐增大，实验组术后不同时间点的生物力学强度均大于对照组(P < 0.05)。术后12周时，实验组植骨区表面连续且光滑，色泽正常，与周围骨质无明显区别，人工骨材料完全降解吸收、被新生骨质替代，骨缺损区已完全愈合；对照组植骨区表面不光滑，表面骨皮质连续，与周围骨质界限不清，人工骨材料降解不完全，骨缺损处由骨痂连接，材料与骨质结合较紧密，骨缺损部分修复。结果表明纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合人工骨材料可促进骨缺损修复，具有较强的成骨能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 纳米羟基磷灰石, 丝素蛋白, 人工骨

Abstract:

BACKGROUND: To obtain a more ideal bone substitute material, nano-hydroxyapatite/silk fibroin composite material has been prepared in the preliminary experiments.

OBJECTIVE: To investigate the effect of nano-hydroxyapatite/silk fibroin composite material for repair of bone defects.

METHODS: Thirty healthy adult rabbits were randomly divided into two groups, and unilateral middle and distal femoral bone defect models were prepared. The experimental group was implanted with nano-hydroxyapatite/silk fibroin composite material, and the control group was implanted with pure hydroxyapatite. At 4, 8, 12 weeks after surgery, the femur was taken from each rabbit for gross, X-ray, biomechanical and histological examinations.

RESULTS AND CONCLUSION: In both two groups, biomechanical strength was gradually increased with time, but the biomechanical strength was higher in the experimental group than the control group at different time points (P < 0.05). At 12 weeks after surgery, in the experimental group, the bone graft had the smooth surface and exhibited normal color with no difference from the surrounding bone, the artificial bone material was completely absorbed and degraded, and bone defects were completely healed; in the control group, the bone graft had no smooth surface on which the bone cortex was continuous and showed unclear boundary with the surrounding bone tissues, the artificial bone materials were incompletely degraded, bone defects were connected by the calluses, the artificial bone materials were closely in conjunction with the surrounding bone tissues, and bone defects were partially repaired. These findings indicate that the nano-hydroxyapatite/silk fibroin composite artificial material can promote bone defect repair and exhibit stronger osteogenic ability.

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Key words: Hydroxyapatites, Silk, Compomers

中图分类号:

R318

孙庆治. 纳米羟基磷灰石/丝素蛋白人工骨修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(8): 1190-1194.

Sun Qing-zhi . Nano-hydroxyapatite/silk fibroin bone substitute for repairing bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(8): 1190-1194.

图/表（结果） 2

2.1 一般情况 30只家兔术后饮食及活动正常，无死亡，无感染发生，均进入结果分析。

2.2 大体观察结果

实验组：植入后4周，骨缺损植入区表面有结缔组织生成，植骨区与周围骨组织界限模糊，伴有大量骨痂形成；植入后8周，植骨区与周围骨组织无明显界限，但骨表面凸凹不平，骨结合紧密；植入后12周，植骨区表面连续且光滑，色泽正常，与周围骨质无明显区别。

对照组：植入后4周，骨缺损植入区表面少量结缔组织生成，植骨区与周围骨组织界限清晰，伴有少量骨痂形成；植入后8周，植骨区与周围骨组织界限模糊，仍可见凸凹处植入的人工骨材料，骨结合不紧密；植入后12周，植骨区表面不光滑，表面骨皮质连续，与周围骨质界限不清。

2.3 X射线检查结果

实验组：植入4周时，植入材料与正常骨组织界面见一狭窄线状阴影，骨痂形成；植入8周时，人工骨材料与骨组织基本骨性结合，界限模糊不清，成骨由两端向中心生长；植入12周时，人工骨材料被新生骨质替代，骨缺损完全被修复(图1A)。

对照组：植入4周时，植入材料与正常骨组织交界处可见狭窄线状阴影，骨痂形成，与实验组无明显差异；植入8，12周时，人工骨材料降解不完全，骨缺损处由骨痂连接，骨缺损部分修复(图1B)。

根据Lane-Sandhu X射线评分，两组植入8，12周的骨组织修复比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 组织形态学检查结果

实验组：植入4周时，树支样成纤维细胞渗入到人工骨材料中并有类骨质样物生成，人骨材料少量降解；8周时，新骨生成较4周时明显增多，伴有大量板层骨质生成，人工骨材料被包围成小的颗粒样，进一步降解吸收；12周时，人工骨材料完全降解吸收，骨缺损区已完全骨愈合(图2A)。

对照组：植入4周时，材料与骨之间有间隙，少许材料降解；8周时，人工骨材料中间有骨质生成，人工骨材料仍少许降解；12周时，人工骨材料还有许多未降解，材料与骨质结合较紧密，骨缺损部分修复(图2B)。

根据Lane-Sandhu组织学评分，两组材料植入4，8，12周的骨组织修复比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。随着时间骨组织修复时间的延长，实验组逐渐形成成熟的哈佛氏系统，骨小梁排列整齐；对照组还有部分未降解的人工材料，骨松质生长活跃，骨皮质形成不连续。

2.5 扫描电镜观察结果

实验组：植入4周时，周围正常骨质与材料之间有明显间隙；植入8周时，人工骨材料部分降解，人工骨材料与周围骨组织结合紧密；植入12周时，人工骨材料完全降解，骨缺损区被新生的骨质替代，骨缺损完全被修复(图3A)。

对照组：植入4周时，周围正常骨质与材料之间有明显间隙；植入8周时，人工骨材料与周围骨组织间隙变小，部分结合紧密；植入12周时，人工骨材料仍大部分未降解，骨缺损部分修复(图3B)。

2.6 生物力学检测结果 三点弯曲强度数据以t 检验统计学分析显示实验组优于对照组(P < 0.05)；随着时间的增长，两组组内生物力学强度逐渐越大，见表3。

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引言

人体骨组织缺损后，如缺损较少可以用自体骨或同种异体骨替代，促进骨的愈合；但临床上出现的骨缺损一般都较大，自体骨无法满足要求，同种异体骨价格又太昂贵。虽然人工骨替代产品众多，但尚没有理想的骨替代材料可满足临床需要^[1-4]。金属及合金材料是早期的骨替代材料，虽然具有强度大的特点，但金属或合金不能与周围骨组织愈合，更不能诱导新骨生成。生物活性陶瓷具有较好的力学特性，但其与周围骨质为纤维连接，影响骨质的稳定性及结合强度^[5-7]。生物玻璃富含磷、钙等氧化物成分，可以与骨组织结合，但其强度有限且制作困难。碳素材料有较高的稳定性及组织相容性，其表面及内部有多孔结构，能耐受体液的腐蚀，但无生物降解作用，并且质地脆、密度低，故要成为骨替代材料不容乐观^[8-10]。高分子材料相对柔韧，与周围骨组织应力传递合理，但高分子材料随着时间的延长性能不断地降低，易疲劳是其致命的缺陷。因此单一材料不能适应人体复杂的内环境。

羟基磷灰石是目前公认最具潜力的骨组织替代材料，但单一的羟基磷灰石机械性差，作为骨替代材料可靠性差^[11-12]。纳米技术的应用使羟基磷灰石在生物、化学、力学等方面都有了显著变化。人体骨组织中的羟基磷灰石主要是纳米针状单晶体结构，沿一定的方位分布在胶原组织中。纳米羟基磷灰石与人体骨组织成分相似，具有良好的生物学活性，所以纳米羟基磷灰石被认为是最具前景的骨组织替代材料^[13]。现今更多人将各种有机与无机材料结合，制作复合材料。丝素蛋白是在人体内可降解并被吸收的高分子蛋白，研究表明其有促进新骨生成的作用，对人体安全、亲和，无致敏反应。纳米羟基磷灰石与丝素蛋白两者间有强烈的化学键合和分子间作用力，复合后羟基磷灰石均匀分布在丝素蛋白中，二者结合紧密，具有与骨组织类似的结构和功能，解决了时空匹配的问题^[14-16]。

纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合人工骨材料是根据不同降解速率材料间相互作用而设计的仿生骨复合材料，复合过程中将材料学与生物学特性相结合，是可降解并被吸收转化的多元混构体系，同时解决了时空匹配问题，提高了人工骨材料的细胞亲和性，改善了人工骨内部气孔分布，这样就有利于新生细胞黏附生长及血管的长入。本实验纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合人工骨植入骨缺损中，观察骨缺损愈合情况。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年3月至2012年12月在佳木斯大学实验动物中心完成。

材料：纳米羟基磷灰石、纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合人工骨均由黑龙江省佳木斯大学工程学院提供。将上述材料制备成直径25 mm×20 mm的圆柱体，实验开始前分别经乙醇及超声处理后备用。

实验动物及分组：健康成年雄性家兔30只，体质量1.5-1.8 kg，由佳木斯大学实验中心提供，许可证号：SYXK (黑)2011021。将30只兔随机均分为实验组与对照组。

实验方法：

骨缺损制作及分组干预：将30只家兔后肢剃毛，兔耳缘静脉注射0.2 mL/kg盐酸氯胺酮，麻醉满意后，固定家兔体位以利于手术操作。无菌操作，切开左股骨远端内侧皮肤，长约2 cm，暴露骨质，在距股骨远端约2.5 cm处用线锯在股骨截骨，同理在第一截骨近端2 cm处再次锯断，形成骨缺损模型。冲洗创口后，实验组于骨缺损处植入纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合人工骨材料，对照组于骨缺损处植入单纯纳米羟基磷灰石材料。冲洗伤口后，逐层缝合，石膏外固，4周后拆除石膏。术后肌注80×10⁴U青霉素预防感染，1次/d，连续3 d。

取材：植入后4，8，12周分别从两组中各选择5只家兔，耳缘静脉注射过量空气处死，行大体标本检查、X射线摄片检查、组织学检查、扫描电镜检查及生物力学检测。

大体标本检查：纵形切开家兔左股骨内侧皮肤、皮下组织，显露骨质，骨膜下剥离，充分显露左侧股骨，将软组织剔除，保留骨痂。观察标本的表面情况，成骨、炎症反应等情况。

X射线检查：通过Lane-Sandhu X射线评分标准评价骨生成情况。①骨形成：无骨形成为0分，骨形成占骨缺损的25%为1分，骨形成占骨缺损的50%为2分，骨形成占骨缺损的75%为3分，骨形成充满缺损区为4分。②与骨连接情况：骨折线清晰为0分，骨折线部分存在为1分，骨折线消失为2分。③骨塑形情况：无塑形为0分，髓腔形成为2分，皮质骨塑形为4分。

生物力学检测：切取完整家兔两侧股骨，剔除软组织后，在MTS-858机器上行三点抗弯实验，测量各组骨质弯曲强度并取平均值进行统计学分析。

组织学检查：截取植入材料部分及5 mm远、近正常股骨，甲醛固定，制作切片，苏木精-伊红染色，并进行Lane-Sandhu组织学评分：①骨连接：无连接为0分，纤维连接为1分，骨与类骨连接为2分，骨连接为3分，骨干完全再生为4分。②松质骨情况：无骨细胞活性为0分，新骨早期聚集为1分，有活性的新骨聚集为2分，松质骨正在改造为3分，松质骨完全形成为4分。③骨皮质情况：无皮质骨生长为0分，皮质骨生长的早期表现为1分，皮质骨正在形成为2分，皮质骨大部分被改造为3分，完全骨再生为4分。

扫描电镜检查：截取骨植入部位及周围正常骨质，将标本用中性磷酸缓冲液配制的3%戊二醛溶液，4 ℃下固定24 h后，常规制备，脱水、包埋、切片，铀染色20 min后铅染色10 min，扫描电镜观察种植体-骨组织结合情况。

主要观察指标：两组标本大体、X射线摄片、生物力学检测及组织学检查结果。

统计学分析：用SPSS 13.0软件进行数据分析，数值均用x(_)±s表示，采用单因素方差分析和q 检验。

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讨论

理想的人工骨材料应该具有与正常人体骨相似的结构及功能，除了具有力学性能、生物学功能外，在结构上还应该具有多孔性，细胞亲和性及骨诱导性，截至目前，并没有理想的骨替代材料。如何设计支架的结构，使其立体构造类似人类骨质的三维结构，并利于细胞在其上黏附及生长，形成与人体骨相同的骨质，具有重要的价值及前景^[17-19]。纳米复合羟基磷灰石材料具有活跃的生物学活性及相容性，与骨有很强的结合能力，随着植入时间的增长，复合材料可以完全降解、吸收，被新生骨质替代^[20-21]，所以人工复合支架材料的性能对骨缺损修复起到了决定性作用。

本实验应用的人工骨材料是由黑龙江省佳木斯大学工程学院研制的纳米级人工骨材料，通过冷冻干燥技术将羟基磷灰石粉末制成多孔结构的纳米支架，钙磷比例为 1∶1.67，等于羟基磷灰石的化学计量；再以氯化钙、磷酸氢化铵为先驱体，制备纳米羟基磷灰石/丝素蛋白粉末，并用冷冻干燥技术使支架气孔尺寸为120-480 μm，检验后抗压强度大，为2.0-3.2 MPa，为有机和无机材料的完美结合，质量比例为7∶3，出气孔率为65%-93%。实验初设计要选择家兔桡骨制备骨缺损模型，因为手术制备骨缺损后对家兔的日常活动及功能影响较小，但由于家兔桡骨直径较小，外周软组织覆盖较少，制备较大的骨缺损模型失败率较高^[22-25]。如制备的骨缺损较小，家兔骨的自愈能力强，就失去了研究骨缺损的价值，但制备的骨缺损过大又面临骨不连接，超出骨修复能力等问题^[26-29]，故本实验实际选择家兔股骨制备骨缺损模型。那么截取多长为临界骨缺损呢？查阅国内外资料有采用截取12 mm、15 mm、20 mm骨缺损模型^[30-33]，故本实验符合实验要求，排除了骨缺损自愈的可能。植入后4周时大体检查可见，对照组骨缺损表面少量结缔组织生成，缺损植入区界限清晰，周围少量骨痂形成；实验组明显优于对照组，骨缺损植入区界限模糊，伴大量骨痂形成。植入后4周时X射线检查可见，对照组植入区与骨组织交界处线性狭窄阴性，与实验组无明显差别，但对照组形成骨痂量明显不如实验组。植入后4周时组织学观察可见，两组材料与周围骨组织间隙有明显差异，实验组有成纤维细胞伸入人工骨材料中生长并伴有类骨样物生成，但对照组间隙明显并有材料降解无填充。植入后4周时电镜观察比较无明显差异。植入后8周时大体检查可见，对照组表面仍能看清人工骨材料，骨结合较实验组差。植入后8周时X射线检查可见，实验组骨组织已经基本骨性结合，但对照组人工骨材料降解不完全，能看到界限区线性结构。植入后8周时组织学观察可见，实验组有大量板层骨质生成，但对照组组织间隙增大，中间有片快状骨质生成，中间填充纤维样组织连接。植入后8周时电镜观察可见，对照组人工骨材料部分与骨组织结合，而实验组材料与骨组织间结合紧密。植入后12周时大体检查可见，实验组缺损植入区骨质与周围骨质无明显却别，光滑，色泽正常；对照组界限不清，表面不光滑。植入后12周X射线检查可见，实验组骨缺损已经完全修复，对照组仍有部分小的骨缺损未修复。植入后12周组织学观察可见，实验组人工骨支架材料消失，已完全被新生骨质替代，对照组中仍有片状人工骨材料未降解。植入后12周电镜检查可见，对照组人工骨支架与骨结合区不紧密，仍有人工材料未降解。随着时间的延长，两组生物力学强度逐渐越大，通过不同时期两组的横向比较显示，纳米级羟基磷灰石与有机蛋白丝素蛋白等制备成的复合支架更有利于骨的生长，复合材料间存在强烈的化学键合及分子间作用力^[34]，羟基磷灰石无机质材料均匀分布于丝素蛋白有机基体中，形成具有与正常人类骨质类似结构和功能的骨替代材料，更有利于骨的生成及材料的降解，从而促进体内新生骨质的长入。本实验对纳米羟基磷灰石/丝素蛋白的研究，以及与纳米羟基磷灰石的对比中可以肯定纳米羟基磷灰石/丝素蛋白人工骨的成骨能力，为进一步寻找更理想的骨替代材料提供了研究的方向及依据。

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